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    静电纺丝法固定化酶研究

    前言:静电纺纳米纤维应用领域十分广泛,在药物缓释、组织工程、过滤分离、能源存储等方面已有相当深入的研究。但利用静电纺丝固定化酶,以及在其基础上进行应用性研究则为数甚少。编者从静电纺丝固定化酶方向进行研究,综述了近年来静电纺丝纳米纤维膜固定化酶领域的研究进展。

    酶固定化

    酶是由活细胞产生的具有催化功能的蛋白质,是一种主要的生物催化剂,它除了一般催化剂所具有的性质外,还具有独特的催化特征,如高催化效率、强专一性和酶活可调节性。但由于酶的蛋白质特征,凡是能够引起蛋白质变性的因素都可能会造成酶的失活,如PH、重金属盐、热、紫外线、剧烈震荡等。即使在最适催化条件下,随着反应时间的延长,酶催化反应速度也会逐渐下降。此外,自由酶在催化后难以回收,给产物分离和提纯都造成困难,导致生产成本提高.这些因素都极大地限制了酶在现代工业中的应用。自20世纪50年代兴起的生物催化剂固定化技术则是基于使酶能够能回收并反复使用这一目的发展起来的。酶的固定化技术可有效地束缚酶的构象,是稳定酶活性的重要方法之一。它在节能、环保、降低成本以及生产连续化等方面显示了巨大的潜在应用价值,为酶的应用提供了广阔的前景。

    酶固定化载体

    在固定化酶技术中,载体的结构和性能对固定化酶的性能有着极大的影响。载体的表面化学组成、几何形状、孔分布等都直接影响固定化酶的活性、稳定性和反应特点。酶的固载量主要受表面积影响,而表面积的大小和材料的孔隙度有关。多孔载体表面积大,这种载体不仅对酶的固载量大,而且可以有效抵御外部环境恶化对酶活性的影响;对于某些固定化方法,载体还要具有功能性基团,如羟基、羧基、氨基等,在酶的固定化时,利用其功能基团与酶蛋白发生反应,通过共价键或配位键与之结合,可大幅提高载体与酶之间的结合力,有利于进一步提高固定化酶的稳定性。随着材料科学的发展,固定化酶的载体材料已从天然高分子材料发展到无机材料、合成高分子材料以及复合材料。

    (1)天然高分子载体

    天然高分子材料最大的特点是具有良好的生物亲和性,而且原料比较易得,适合担当酶的载体材料。近年研究热门的新载体有壳聚糖、胶原蛋白、海藻酸钠、纤维素等。

    (2)合成高分子载体

    合成的高分子聚合物化学性质稳定,易于成型,同时具有良好的力学性能,以合成高分子材料作为酶固定载体具有良好的应用前景。合成高分子材料作为载体固定化酶的研究有很多,其中既有PVA、PE、PAN、PA、PMMA等,它们被直接或改性后用于固定化酶,也有将不同单体聚合,制备具有独特功能的酶固定化载体。

    (3)无机载体

    传统的无机载体主要是 SiO2、Al2O3、活性炭等,这些载体具有简单易得,价格低,机械强度高等优点,一般是采用吸附法或包埋法固定化酶,也有是用小分子化学改性后用共价法固定化酶。

    1. 有机无机复合载体

    无机载体的结构不容易调控,传质效果不理想,近年来,人们开始将无机材料与有机高分子结合起来,制备有机/无机复合材料载体,其中磁性材料制备的酶固定化载体得到普遍重视。

    静电纺丝静电纺丝纳米纤维膜固定化酶

    采用静电纺丝技术制备得到的纳米纤维膜已广泛应用于生物医药学、过滤、复合材料及传感器等领域。静电纺丝纳米纤维膜具有比表面积大、结构丰富、持久耐用及易于分离回收等优点,将电纺纳米纤维膜作为固定化酶的载体,有利于酶与底物充分接触,能有效提高酶的催化效率和重复利用性,因此它被认为是一种具有广阔应用前景的酶固定化基质,目前已经成静电纺丝纳米纤维膜应用研究领域的研究热点之一。

    近年来,随着纳米材料研究的兴起和静电纺丝技术的日趋成熟,静电纺丝纳米纤维膜固定化酶的研究取得了较大的进展,通过静电纺丝技术已经成功制备得到了电纺纤维膜固定化脂肪酶、电纺纤维膜固定化蛋白酶等,并在生物反应器和生物传感器领域得到了实际应用。根据电纺纳米纤维膜的制备特点及其本身具有的特征,电纺纤维膜固定化酶的方法主要分为表面担载法和包埋法等。

    (一)表面担载法

    表面担载法是指直接将没有经过任何表面修饰的静电纺丝纳米纤维膜用于酶的固定化。这种方法所选用的电纺材料一般为天然高分子材料或者人工合成的高分子聚合物材料。由于天然高分子材料原料易得,且具有良好的机械强度、热稳定性、化学稳定性以及较强的酶结合能力等优点,因此常被认为是优良的酶固定化载体材料。目前所研究的天然高分子材料包括壳聚糖、丝素蛋白和纤维素等。

    丁玲利用静电纺丝法制备PA6/PVA复合纳米纤维膜,并以其为载体固定纤维素酶,固定化纤维素酶相较于自由纤维素酶最适宜酶学反应温度、pH、热稳定性、重复使用稳定性、贮藏稳定性均优于自由酶。

    (二) 活性功能基团担载法

    将含有活性功能基团聚合物制备电纺纳米纤维膜,或者将某些含有功能基团的材料电纺成纳米纤维膜后将其活化,然后用于酶的固定化。由于酶固定的作用力较弱,使得在使用过程中酶分子易从载体上脱落,影响固定化酶的重复利用性能。为了克服酶易从固定化载体上脱落的问题,人们通常含有活性功能基团聚合物制备电纺纳米纤维膜,或者将某些含有功能基团的材料电纺成纳米纤维后将其活化,然后用于酶的固定化。当点纺纳米纤维膜表面具有活性基团时,载体与酶分子之间的作用力主要是化学键力,可以大大提高固定化酶的稳定性,目前,这种含有活性基团的电纺纳米纤维膜被更多地应用于酶固定化领域。使用含有活性基团的电纺纳米纤维膜作为酶固定化载体,可以有效提高固定化酶的性能。

    Jia等首先报道了以含有活性基团的聚苯乙烯电纺纳米纤维膜作为酶的固定化载体,他们用化学方法将α-蛋白酶共价吸附固定在含有活性基团的电纺纤维膜表面。经测定发现,该电纺纳米纤维膜固定化酶在水溶液中的催化活性相当于游离酶的65%以上,而在正己烷和异辛烷有机溶剂中的活性比游离酶高3个数量级。同时,固定化酶在有机溶剂中表现出比游离酶更好的稳定性。此外,当纤维直径为120nm时,该电纺纤维膜的载酶量可达到1.4wt%,相当于超过27.4%的纤维膜外表面吸附固定上一层生物酶分子。然而随着纤维直径的增加,载酶量显著降低。这是因为纤维直径能对纤维膜的比表面积和纤维表面活性基团的数量产生较大影响,从而影响电纺纤维膜的载酶量。通常认为纤维直径越小,纤维膜的比表面积就越大,使得暴露在纤维表面的与酶分子结合的活性位点的数量也越多,载酶量也越大。大多数研究表明,直径在< 100-500nm的电纺纤维比较适合用于固定化酶。

    (三)化学交联

    无论是在不含活性基团的电纺纤维膜表面通过物理吸附作用固定化酶,还是在含有活性基团的纤维膜表面利用化学键力固定化酶,均只能在纤维膜的外表面吸附单层酶,限制了纤维膜的载酶量,且在反应过程中仍有酶脱落现象。为了克服以上的缺点,研究人员通过与化学交联法相结合以提高酶载量和固定化酶的定性。

    交联法是利用具有功能性基团的试剂与酶分子之间用共价交联的固定化方法。戊二醛是最常用的交联剂,其它交联剂有双氨联苯、鞣酸等。Fernando L G 等以多种高分子聚合物为基体,通过改性接上氨基,并以此为载体交联法固定化酶,交联剂为戊二醛。但是交联法由于在固定化过程中有酶分子间发生化学反应,酶失活较为严重。

    (四)表面修饰电纺

    为了使电纺纳米纤维膜在酶固定化领域有更好的应用,一些研究者提出先对电纺纤维膜进行修饰,然后进行酶的固定化。该方法可以改善载体材料表面的化学性质,提高固定化酶的酶活性能。

    根据对电纺纳米纤维膜进行修饰的目的不同,修饰纤维膜表面担载法可以分为提高纤维膜表面的生物相容性,改善酶在纤维膜表面的可流动性,以及增加纤维膜的电导率等几种方法。

    (1) 纤维膜表面的生物相容性

    该方法主要是通过利用生物相容性良好的物质对聚合物材料或者电纺纤维膜进行修饰,或者直接用亲水性的聚合物与疏水性的聚合物一起电纺以提高纤维膜的生物相容性。修饰后的纤维膜可以大大提高固定化酶的催化活性。

    (2) 纤维膜表面的可流动性

    这种方法主要是在纤维膜表面引入接枝,使该接枝能作为酶与纤维膜载体之间的连接体。在这种情况下,酶分子不直接吸附在纤维膜表面,而是通过接枝与纤维膜连接在一起,或者酶分子直接吸附在接枝上,达到酶固定化目的。

    (3) 纤维膜的电导率

    增加纤维膜的电导率主要是针对氧化还原酶的固定所提出的。通过对电纺纳米纤维膜修饰具有良好电导率的物质改善纤维膜的导电性,增加反应中电子转移速率,从而提高酶的催化活性。

    磷脂共聚物具有良好的生物相容性,浙江大学黄小军等采用静电纺丝的方法制备丙烯腈l/[ 2-(甲基丙烯酰氧) 乙基]磷脂酰胆碱(MPC)共聚物电纺膜作为酶固定化的载体,进而将脂肪酶吸附固定在载体上。结果表明, 由于静电纺丝纤维膜具有纳米或者亚微米尺寸,有利于提高载酶量,脂肪酶在共聚物电纺膜上的载酶量可以达到20mg/g以上。作者还比较了聚丙烯腈和类磷脂修饰丙烯睛共聚物电纺膜上固定化酶活性保留率。对于聚丙烯腈电纺膜,酶活性保留率为51.6%。而对于类磷脂修饰共聚物电纺膜,由于类磷脂修饰共聚物膜能为固定化酶营造一种生物相容性的微环境,酶活性保留率可以达到78.6%。可见,类磷脂修饰丙烯腈共聚物电纺膜上,固定化酶的活性得到显著升高。

    包埋法

    包埋法固定化酶是通过静电纺丝技术,在制备纳米纤维膜的过程中直接将酶纺入纳米纤维内部,从而实现酶的固定化。该方法是一种原位固定酶的方法,通过该方法制备得到的固定化酶具有载酶量高的优点。根据所采用静电纺丝技术的不同,可以将纤维膜包埋法固定化酶分为混合电纺包埋、同轴电纺包埋和乳液电纺包埋。

    (五)混合电纺包埋

    混合电纺包埋法通常是将酶与亲水性聚合物直接混合形成凝胶,然后再引入普通静电纺丝装置进行电纺,可得到载酶纳米纤维膜,这种方法实现了静电纺丝纳米纤维膜对酶的原位固定。利用该方法固定化酶对纺丝装置要求不高,成本低廉且操作简单。但由于酶的蛋白结构在电纺过程中受到一定程度的破坏,会导致部分酶活损失。

    为了提高酶在电纺过程中的稳定性,有学者提出先将酶活化,然后将活化酶与聚合物溶液混合共纺。结果表明,活化酶能有效地被固定在电纺纤维中,且活化后的酶经过电纺固定后,在异辛烷溶液中表现出的酶活比未经过任何处理的酶要高4. 5倍。然而,交联通常也会破坏酶分子结构,使酶活发生一定程度的降低。

    许鑫华等将葡萄糖氧化酶分散到PVA纺丝液中,进行静电纺丝,采用混合包埋法获得固定化酶,并用于构筑安培型葡萄糖生物传感器。Katarzyna S等将脲酶分散到PVP纺丝液中,利用静电纺丝制得固定化酶的复合纳米纤维,由于纳米纤维的小直径和大的比表面积,使得混合包埋法固定于纳米纤维中的脲酶对氨水的检测限达到×106级。

    (六)同轴电纺包埋

    利用同轴电纺技术可以直接将酶包埋在聚合物材料纤维内部形成核-壳结构的载酶纤维,以实现静电纺丝纤维膜对酶的原位固定。但是由于酶是一种蛋白质,它所具有的复杂的三维结构及其强大的分子间或分子内部作用力使其不可能单独被电纺成纳米纤维。所以在同轴电纺包埋法中,多数情况下要求用酶与高分子聚合物溶液一起电纺成为核-壳纤维中的“核”部分。又因为大多数酶都是水溶性的,所以要求与酶一起电纺的高分子聚合物材料也是水溶性的。同时,为了保证电纺纳米纤维膜在水溶液中的稳定性,使其不发生溶胀,一般要求电纺纳米纤维所用的“壳”材料是疏水性聚合物。

    姬晓元等将辣根过氧化物酶(HRP)和甘油水溶液作为“核”,以溶解于有机溶剂中的聚氨酯(PU)溶液 为“壳”,然后利用同轴电纺将其纺成纳米纤维,实现酶在中空纳米纤维腔室内的原位包埋。在上述电纺条件下,固定化HRP的活性收率为游离酶的80%,米氏常数Km几乎与游离酶相同,固定化酶在60℃下的半衰期比游离酶提高17倍。

    (七) 乳液电纺包埋

    该技术能够通过直接电纺油-水或者水-油乳液制备壳-核结构载酶纳米纤维,实现对酶的原位包埋固定。在该方法中,通常是先向聚合物溶液中加入一定量的表面活性剂以降低溶液的表面张力,然后再与酶溶液混合形成均匀乳液,最后将乳液引入普通的静电纺丝装置进行电纺而得到载酶纤维。与同轴电纺技术不同,乳液静电纺丝技术是一种经济高效的制备载酶纳米纤维的方法。但由于在乳液电纺体系中引入了表面活性剂,使得纺丝液性质发生较大变化,从而使纺得的纤维结构不易控制。

    结语

    静电纺丝纳米纤维膜固定化酶能有效提高酶的催化效率、稳定性和重复利用性,是一种具有广阔应用前景的酶固定化方法,但是仍存在如何提高纤维膜固定化酶的催化活性和稳定性等问题,此外,目前研究主要局限于实验室研究,离大规模的生产应用还有很长一段距离。因此,如何改进静电纺丝纳米纤维膜的生产工艺,促进其达到工业化的应用要求,以及拓展其在环境检测等领域中的应用将可能成为静电纺丝纳米纤维膜固定化酶研究中的主要方向。

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